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传统单抗技术这么玩,是不是会很通透

 

单抗是个好东西,但是一提到单抗,很多人就脑壳疼,理论容易实践难。

l  融合一次两次不长

l  亚克隆检测满板黑或者满板白

l  好不容易得到个阳性,污染了

l  历经千辛万苦没筛到自己想要的抗体

 

做技术的都是性情中人,从不吝啬于分享自己的“私房秘技”

首先,小鼠免疫这关需要过

尽信书则不如无书,书上说可以用6-8周的Balb/c小鼠将进行免疫,其实这个十分不妥,一般来说用于免疫的小鼠一定要根正苗红,种系来源要好,很多实验室为了省钱,买只公鼠再买只母鼠回来自己繁殖饲养,这样的老鼠质量是不过关的,有时候打腹水都不长,那你可能会说那我干脆用它来做饲养细胞吧,我要告诉你多此一举,我会告诉你不用饲养细胞的办法;对于老鼠的周龄,最好选用8周龄以上的,这样免疫效果会更好,我们发现6周龄的小鼠免疫后经过应激以及免疫刺激后,往往个头僵化,生长停滞,效价也不高,这是我们肉眼可以观察到的事情,肉眼没有看到的很多负面影响还暗藏其中,严重影响我们的实验效果。性格火急的实验者拿到小鼠就用,心急吃不了热豆腐;拿到合格的Balb/c小鼠之后,我如果告诉你,对于大多数的抗原在2-4周可以完成免疫你相信么?我们采用的是类似于狂犬疫苗的免疫程序,使用的是Frdbio水溶性纳米佐剂,比传统的弗氏佐剂效果要好,使用起来更为简便。传统的弗氏佐剂乳化起来非常麻烦,特别是对于体积较小的微量抗原,乳化更为麻烦,相对损失量更高。传统的弗氏佐剂主要成分是矿物油和多糖,有的是用羊毛脂,矿物油的有机成分很可能会影响到抗原的二级结构,所以我们想要筛选到构象表位的抗体,对于比较珍贵的抗原,建议尽可能考虑水溶性纳米佐剂。我们的大量案例表明,使用水溶性佐剂21天左右ELISA测试的效价可以大于1:10^6。

融合前的免疫冲击,如果可以通过尾静脉冲击做好,如果做不到老老实实打腹腔。

其次,细胞培养和融合

细胞培养的基本技能自不必说,做到不污染,操作标准,动作娴熟,习惯要好,细胞消化(SP2/0不需要消化)和传代要做到火候正好,如果该换液的时候不换液,细胞由于缺少营养老死,半死不活,后期及时挽救回来也已经变性了。很多人传细胞细胞用蛮力使劲吹打培养基起泡,势必影响细胞,会对细胞造成机械性损伤;捶打时间过长,培养基变成紫红色的,液回造成细胞裂解;市面上T25和T75的培养瓶由于设计的原因,往往脖颈那部分细胞不容易吹到,再次分瓶培养的时候,这部分细胞会老死,影响整体的细胞群质量。

真正优良的SP2/0在显微镜下观察应该是一粒一粒的,像钢豆,大小均匀,没有或者很少有异形细胞,且密度适中均匀,没有漂浮细胞。做单抗SP2/0来源一定要正,市面上那么多的SP2/0,大家传来传去,性能各异,很多已经不太适合于做融合了,或者效率很低,后者后期即使融合成功,细胞株很难稳定,筛选不到阳性克隆。很多实验者听信民间偏方把SP2/0注射到老鼠的背部,让其恢复活力,其实这个有点扯淡了,所谓恢复的活力是生长活力,不是融合和作为Fusion Partner的活力,我不知道我是否说清楚这个问题了。一般正规的单抗公司,会定期对sp2/0进行亚克隆,获取众多单克隆集落,分别测试其作为Fusion Partner应该具有的专业属性,然后放大培养,冻存一批保种,每次取用一支,用到一两个月直接丢弃,再重新取新的一支复苏使用。对于一般科研院所或者小公司,不可能有精力做这件事情,再加上对于SP2/0使用频率一般不是很高,从正规来源获取细胞,小心冻存一批原种足够应付实验普通的单抗工作。

再次,融合血清很重要

很多人做单抗细胞融合,反反复复就是不成功,都快憋出内伤。细胞融合所涉及的几个关键试剂培养基,融合剂、培养血清和HAT试剂。其中血清作为紧要,如果融合操作规范,长不出集落十有八九是血清问题,正规的单抗公司都会定期向血清厂家索要不同批号的血清小样进行细胞融合测试,择优购买测试效果最好的批次,于小公司或者科研院所实验室一般是是做不到这个工作的。购买单抗融合专用血清MAC0010是比较好的选择,但是市面上号称单抗细胞融合血清的也是很多,需要擦亮眼睛,仔细甄选。其实还有更好的选择,直接购买可以适合于细胞融合的培养基直接使用,成本并不比自己用血清配制的高,最关键的是这个培养基再融合细胞铺板的时候不需要你加入饲养细胞,是不是很惊喜,是不是很意外;这个培养基还可以直接用于亚克隆,同样不需要制备饲养细胞。杀老鼠制备饲养细胞还是有点小痛苦的,一不小心还会污染。

最后,就是筛选问题

单抗筛选的最常用的手段是间接ELISA方法,这是初筛最好的利器。我们在实际工作中经常会遇到满板子都是蓝色或者满板子都是白板,这个就需要我们在筛选之前建立好ELISA实验方法,至于方法怎么建,参照抗体效价的检测(ELISA)。经过初筛后,我们会得到阳性孔,阳性孔经过补液二次复筛之后就可以进行亚克隆了,初筛和亚克越早越好,一般融合后7-10天内,因为越晚的话,阳性孔里面如果有非目标细胞,它们生长速度要比目标细胞快很多,会严重覆盖目标细胞,造成后期亚克不到目标阳性细胞。为什么需要二次补液复筛呢?因为阳性孔里面的抗体可能是前期细胞(包括没有融合的细胞和融合期不稳定细胞)生长留下来的,二次补液之后,如果孔内分泌抗体的阳性细胞不在了,二次筛选值会很低或者阴性。

做单抗,大家最不喜欢得到的是IgM亚型,原因是这个玩意后期很难纯化,怎么才能避免筛选到IgM亚型抗体细胞株呢?我们在间接ELIS时选用剔除针对IgM亚型的羊抗小鼠IgGs-HRP即可,世面上很少有这种抗体,我们也是在实践中快被憋出内伤的时候才研发出这款二抗[Goat anti-mouse(IgGs-IgM)(AffiniPure ,Horseradish Peroxidase conjugated]

至于筛选还是要提及的一个问题,间接ELISA只是初选,你最终希望抗体达到什么样的境界,你最好在细胞上清阶段就设计出这样的技术方案;基于现实的种种原因,可能在上清阶段实施终极应用抗体验证很困难,比如受到培养液成分干扰,收到上清培养液量少或者抗体总量偏少等等的干扰。总之,单抗是很诚实的,你用什么样的条件筛选那你就得到什么样的抗体。

 

对于污染问题,那是实验室控制问题,实验习惯问题,加上所使用实际的问题了,最招人恨的是支原体污染;其他的细菌污染一般用双抗生素就解决了,实在不行用个三抗,真菌问题,一般不太会出现,除非实验室大面积污染。支原体污染太普遍了,在污染不是很严重的情况下,细胞株又非常珍贵的话,可以试试我们的除支原体试剂。

 

关于亚克隆

亚克隆是个体力和技术活,教科书上我们在亚克隆的时候平均没孔0.8个细胞,这样没孔分到1个细胞的概率最高,这个是根据一个概率分布原理,在理想状态下的一个分配概率,事实上,由于细胞的状态和自身特性,已经培养基支持细胞生长能力问题,亚克隆的时候平均每孔分配的细胞数量是需要做适当修正的,也就是说我们如果过每孔按照0.8个细胞去亚克隆的话,估计很多孔里是长不出克隆的,经过实验室实验验证,我们在使用本公司生产的单抗亚克隆专用培养基的情况下,如果按每孔平均分配2个细胞的情况下,长出单克隆细胞的孔数的可能性最大,具体分配多少个细胞最为合适?这需要根据各自实验室情况各自修正,另外,细胞计数一定要准确,至少技术两次,如果两次计数的结果差异不大,数字才可以采信。我们使用这款培养基进行亚克隆最大的优势是不需要加饲养细胞,随时随地可以进行亚克隆,既避免杀小鼠,又可以减少工作量,还可以避免不必要的人为造成的污染。

 

传统单克隆抗体技术经久不衰,经典的就是经典的,新的单抗新技术又不断催生,比如基因工程抗体,目前这个技术比较热门,特别是兔单克隆抗体技术更是吵得火热。感兴趣的小伙伴继续关注我们,我们后期会推出更多实用秘籍,让你轻松入门基因工程抗体(兔单克隆抗体)。

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