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产品货号 |
ARL0021K 系列 |
保存条件 |
-20℃，避光保存 |
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有效期 |
18 个月 |
用途 |
抗体/蛋白/多肽 FITC 标记 |
一、产品概述
本试剂盒用于对含有伯氨基的抗体、蛋白、多肽或其他生物大分子进行 FITC 快速标记。FITC 的异硫氰酸酯基团可与蛋白 N 端氨基及赖氨酸侧链 ε-氨基反应，形成稳定的硫脲键，从而获得荧光标记产物。
试剂盒配套超滤管、标记缓冲液、助溶剂、清除指示剂和标记物保存液，可完成样品缓冲液置换、标记反应、游离 FITC 清除与标记物回收。
二、试剂盒组分
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组分 |
小规格 |
中规格 |
大规格 |
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活性 FITC |
2 mg |
4 mg |
6 mg |
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超滤管 |
1 支 |
1 支 |
1 支 |
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FITC 助溶剂（DMSO） |
1.5 mL |
3 mL |
4.5 mL |
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标记缓冲液 |
30 mL |
60 mL |
90 mL |
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清除指示剂 |
1 mL |
2 mL |
3 mL |
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标记物保存液 |
2 mL |
4 mL |
10 mL |
三、型号选择
根据待标记物分子量和标记体积选择合适截留分子量与最大体积的超滤管。一般原则：超滤管截留分子量应低于待标记物分子量的1/2，且反应总体积不超过超滤管建议最大体积。
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产品编号 |
最大标记体积 |
待标记物最小分子量 |
可标记抗体量 |
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ARL0021K-3K-0.5mL |
0.5 mL |
3 kDa |
0.2-10 mg |
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ARL0021K-3K-4.0mL |
4.0 mL |
3 kDa |
1.0-80 mg |
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ARL0021K-3K-15mL |
15 mL |
3 kDa |
5-300 mg |
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ARL0021K-10K-0.5mL |
0.5 mL |
10 kDa |
0.2-10 mg |
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ARL0021K-10K-4.0mL |
4.0 mL |
10 kDa |
1.0-80 mg |
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ARL0021K-10K-15mL |
15 mL |
10 kDa |
5-300 mg |
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ARL0021K-30K-0.5mL |
0.5 mL |
30 kDa |
0.2-10 mg |
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ARL0021K-30K-4.0mL |
4.0 mL |
30 kDa |
1.0-80 mg |
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ARL0021K-30K-15mL |
15 mL |
30 kDa |
5-300 mg |
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ARL0021K-50K-0.5mL |
0.5 mL |
50 kDa |
0.2-10 mg |
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ARL0021K-50K-4.0mL |
4.0 mL |
50 kDa |
1.0-80 mg |
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ARL0021K-50K-15mL |
15 mL |
50 kDa |
5-300 mg |
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ARL0021K-100K-0.5mL |
0.5 mL |
100 kDa |
0.2-10 mg |
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ARL0021K-100K-4.0mL |
4.0 mL |
100 kDa |
1.0-80 mg |
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ARL0021K-100K-15mL |
15 mL |
100 kDa |
5-300 mg |
四、FITC 用量建议
FITC 标记反应中，真正需要控制的是 FITC 分子数与待标记蛋白分子数的比例。固定“每毫升加 25 μL 或 50 μL”只适合特定蛋白浓度；一旦蛋白浓度改变，实际投料摩尔比也会明显改变。
4.1 参照体系如何理解
经典 FITC 标记条件中，蛋白溶液建议至少 2 mg/mL；每 1 mL 蛋白溶液加入 50 μL、1 mg/mL 的 FITC 溶液，相当于每毫升反应体系加入约 50 μg FITC。对于 IgG（约 150 kDa）且蛋白浓度为 2 mg/mL 时，该条件折算为 FITC:IgG 约 10:1 的投料摩尔比。
本试剂盒示例中，2 mg/mL IgG 每 1 mL 加入 25 μL、2 mg/mL FITC，实质上同样是每毫升加入约 50 μg FITC；若按 1 mg IgG、0.5 mL 反应体积计算，则加入 12.5 μL、2 mg/mL FITC，仍对应约 10:1 的投料摩尔比。
4.2 1:20 还是 1:30？取决于蛋白浓度和目标标记强度
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IgG 浓度 |
固定加入 50 μg FITC/mL 时的近似投料比 |
建议用途 |
风险提示 |
建议 |
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2 mg/mL |
约 10:1 |
IgG 常规起始条件 |
通常较稳妥 |
首选起点 |
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1 mg/mL |
约 20:1 |
低浓度样品或希望提高信号 |
背景可能升高 |
可用，但需验证背景 |
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0.67 mg/mL |
约 30:1 |
样品无法浓缩且需要较强信号 |
过标记风险增加 |
谨慎使用，建议小试 |
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<0.5 mg/mL |
>40:1 |
不推荐直接按固定体积加 FITC |
易过标记、回收低 |
优先浓缩或降低 FITC 加量 |
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推荐策略 抗体样品优先调整到约 2 mg/mL，并以 FITC:IgG 投料比约 10:1 作为首发条件。若信号偏弱，可在小试中提高到 15:1 或 20:1；若背景偏高、亲和力下降或功能受影响，则应降低 FITC 加量或缩短反应时间。1:30 并非默认首选，更适合低浓度样品无法浓缩、且已知背景可控的探索条件。 |
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4.3 通用计算公式
·蛋白量（nmol） = 蛋白质量（mg） ÷ 蛋白分子量（kDa） × 1000
·所需 FITC（nmol） = 蛋白量（nmol） × 目标投料摩尔比
·所需 FITC（μg） = 所需 FITC（nmol） × 389.4 ÷ 1000
·FITC 溶液体积（μL） = 所需 FITC（μg） ÷ FITC 储备液浓度（mg/mL）
·DMSO 体积分数（%）≈ FITC 溶液体积 ÷（蛋白溶液体积 + FITC 溶液体积）× 100%
说明：1 mg/mL 等于 1 μg/μL，因此 FITC 储备液浓度以 mg/mL 输入时，可直接用 μg ÷ mg/mL 得到 μL。
五、实验前准备
六、操作步骤（以 1 mg IgG 为例）
1. 样品换液与浓缩
取 1 mg 待标记 IgG 加入合适截留分子量的超滤管中，加入标记缓冲液至不超过超滤管最大工作体积，12,000 × g 离心 10 min。根据需要重复 2-4 次，最后用标记缓冲液将 IgG 调整至约 2 mg/mL。
2. 加入 FITC
按计算结果加入 FITC 溶液。若使用 1 mg IgG(约 0.5 mLX2 mg/mL )的示例条件，可加入约 12.5 μL 的 2 mg/mL FITC 溶液，对应 FITC:IgG 约 10:1。加入时应缓慢滴加并轻轻混匀，避免局部浓度过高。
3. 避光反应
将反应体系置于 37℃ 避光温育 60 min 以上。对活性敏感蛋白可降低温度或缩短反应时间，并通过小试优化。
4. 加入清除指示剂
标记结束后，加入约 1/10 反应体积的清除指示剂，轻轻混匀。该步骤用于辅助判断游离 FITC 的清除过程。
5. 超滤去除游离 FITC
12,000 × g 离心 10 min，弃去滤液。向超滤管中加入适量标记缓冲液，轻轻吹打混匀后继续离心。重复洗涤，直至超滤管中基本无蓝色残留。
6. 回收与保存
加入适量标记物保存液或适合样品的保存缓冲液，轻轻吹打并回收超滤管中的 FITC 标记产物。产物建议 2-8℃ 避光短期保存；长期保存需根据蛋白稳定性加入适合的保护剂，避免反复冻融。
七、FITC 标记产物的 F/P 计算
F/P（Fluorescein/Protein）表示平均每个蛋白分子结合的荧光素分子数。测定时使用石英比色皿或已进行光程校正的读数，分别读取标记产物在 280 nm 和 495 nm 的吸光值。A280 建议处于 0.2-1.4 区间；若超出该范围，应适当稀释后重新读数。
7.1 FITC-IgG 产物
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IgG 专用公式
A280,corr = A280 - 0.35 × A495 |
7.2 其他 FITC-蛋白产物
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通用蛋白公式
A280,corr = A280 - 0.35 × A495 |
其中 MW 为蛋白分子量（kDa）；389 为 FITC 分子量；195 为结合态 FITC 在 490 nm、pH 13.0 条件下的 E0.1% 值；E0.1%280 为该蛋白 1.0 mg/mL 时在 280 nm 的吸光值。对于 IgG，常用 E0.1%280 = 1.4。
7.3 结果判读
F/P < 1：标记偏低或偏保守。若用于直接荧光检测，可能出现信号不足。
F/P 1–3：温和标记区间，适合对亲和力、构象或功能较敏感的样品。
F/P 3–6：常用的 FITC-IgG 工艺开发参考区间，通常可在荧光信号和背景之间取得较好平衡。
F/P > 6：高标记区间，信号可能增强，但自淬灭、非特异背景升高、亲和力下降或蛋白功能受影响的风险增加。
八、常见问题与优化建议
为什么同样加 12.5 μL FITC，有的样品背景高？
因为样品浓度、分子量和可反应氨基数量不同。固定体积并不等于固定投料摩尔比。低浓度样品若仍按固定体积加入 FITC，实际投料比会显著升高。
能否直接使用 1:30？
可以作为探索条件，但不建议作为所有抗体的默认条件。对于 IgG，1:30 更适合低浓度样品或需要增强信号的小试；若用于常规 2 mg/mL IgG，可能增加过标记风险。
标记后为什么一定要去除游离 FITC？
游离 FITC 会造成高背景、假阳性信号和保存稳定性问题。超滤清除至指示颜色消失后，仍建议根据实验灵敏度适当增加洗涤次数。
结果 F/P 合适就一定好用吗？
不一定。F/P 是质量控制指标之一，最终仍需用 ELISA、流式、免疫荧光、WB 或功能实验验证信号强度、背景和特异性。
* 本产品仅供科研使用，不用于临床诊断或治疗。
