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抗体的纯化——沉淀法

抗体的纯化——沉淀法

 

抗体的纯化方法很多,最为常用的为以下四种方法,基于工业化生产工艺开发的规模化生产方法要比这些复杂得多,甚至多个纯化策略联合使用,有兴趣的科研工作者可以查阅相关的文献。

1)沉淀法利用抗体蛋白疏水性不同,提高盐离子浓度蛋白沉淀,常用的沉淀方法有硫酸铵沉淀法、辛酸沉淀法、辛酸-硫酸铵沉淀法、优球蛋白沉淀法和聚乙二醇沉淀法;这类纯化各有各的优缺点,往往对某些亚型抗体有偏爱性。

2)广谱亲和纯化这类纯化主要是利用金黄色葡萄球菌ProteinA /G蛋白可以特异性与抗体的Fc结合的原理进行的。

3)抗原特异性纯化:将特异性的抗原偶联到琼脂糖凝胶等固相载体上,纯化方法与ProteinA /G纯化方法相同。

4)离子交换法:DEAE-Sephadex A-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50)为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为pH6.85~7.5),其余均属酸性蛋白。pH7.2~7.4的环境中,酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通过柱层析,γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。

1. (NH4)2SO4沉淀法纯化抗体

1.1 饱和硫酸铵配制:无菌去离子水加入足量硫酸铵之后,加热到65℃以上,在磁力搅拌器上搅拌溶解至底部仍有未溶解的硫酸铵,待冷却后,取上清滤纸过滤。

1.2 样品(血清或腹水),12,000rpm离心30min(4℃),除去细胞碎片,保留上清液并测量体积。

1.3 边搅拌边缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液到上清液中,溶液放在磁力搅拌器上室温搅拌6h或搅拌过夜(4℃),使蛋白质充分沉淀。

1.4 蛋白溶液12,000rpm离心30min(4℃),沉淀用原样品体积的PBS溶液重悬,重悬后12,000rpm离心10min(4℃),上清转移到一个新离心管。

1.5 边搅拌边慢慢加入1/2体积的饱和硫酸铵溶液到上清液中(此时硫酸铵浓度为33%饱和),溶液放在磁力搅拌器上搅拌6h或搅拌过夜(4℃),使蛋白质充分沉淀。

1.6 蛋白溶液12,000rpm离心30min(4℃),沉淀用原样品体积的PBS溶液重悬,重悬后12,000rpm离心10min(4℃)。

1.7 沉淀溶解后放入透析袋对 PBS 溶液透析 24~48 h(4℃ ),每隔 3-6 h换透析缓冲液一次,以彻底除去硫酸铵。

(硫酸铵是否透析干净的判断标准:可取透析袋内少许溶液,加入等体积的0.02M BaCl2溶液,如果没有沉淀表明硫酸根离子除尽。)

硫酸铵沉淀法的优点是适合抗体大规模纯化或者浓缩。缺点事某些抗体经硫酸铵沉淀后抗体的活性会有所降低或丧失,抗体纯度不高。

2. 辛酸-硫酸铵沉淀纯化抗体

辛酸-硫酸铵方法一般用于纯化单克隆抗体。

2.1 腹水用双层滤纸过滤,除去杂质、脂肪及细胞碎片。4℃,12,000r/min,离心15min,收集上清,弃沉淀。精确定量腹水体积。

2.2 腹水中加入2~4倍体积的醋酸盐缓冲液(0.06M,pH4.8)磁力搅拌混匀,用2MHCL调pH至4.5~ 4.8。

2.3 磁力搅拌下缓慢加入正辛酸,33μL/mL腹水,加完后室温磁力搅拌半h,后置4℃静置2h以上。

2.4 4℃,12000r/min,离心5min,收集上清,双层滤纸过滤,收集滤液。

2.5 量取滤液体积,加入1/10体积的0.1M PBS (pH7.4),用2M NaOH(记录NaOH体积)调pH至7.4。

2.6 将上清冰浴预冷,加硫酸铵固体至0.277g/mL,边加边搅拌,并于30min内加完,置4℃过夜。

2.7 12000r/min,离心15min,弃上清;用1/10腹水体积0.01M PBS溶解沉淀; 对0.01M PBS(pH 7.4)透析一天,离心去掉不溶杂质,用纯水进行透析,优球蛋白析出后离心收集澄清抗体溶液分装置于-20℃冻存。

 (辛酸-硫酸铵沉淀主要缺点是只适合于提纯IgG1和IgG2b,不能用于IgM和IgA的纯化;其优点是操作简单方便,抗体回收率和产率均高,抗体活性损失小。)

3.优球蛋白沉淀法 

优球蛋白沉淀法适用于IgG3和IgM型单抗的提取,用该法纯化的抗体活性几乎保持不变,对IgG3单抗的回收率高于90%,对IgM单抗的回收率为40%~ 90%。

4.聚乙二醇(PEG)沉淀法 

PEG沉淀法原理PEG具有强极性,产生极强的亲水性,夺取水分子导致抗体分子析出;该方法常用于IgM的纯化,PGE沉淀可使IgM达到较高的纯度(大于90%)和回收率(大于80%)。


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