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抗体的纯化—Protein A G.L亲和纯化

抗体的纯化—Protein A G.L亲和纯化

 

Protein A具有和IgG的Fc片段结合的活性。Protein A能与大部分哺乳动物的IgG反应,不同属种的抗体对Protein A的亲和力不同;据此可将Protein A作为配基结合在琼脂糖凝胶上用于分离IgG亚类,一步纯化所得抗体的纯度大于99%;洗脱液的抗体浓度大于10 g/ L;适用于所有人源的(非IgG3)抗体和Fc融合蛋白。

Protein G不仅与免疫球蛋白的恒定区相结合,且与白蛋白、α2-巨球蛋白相结合,这使得用Protein G亲和色谱提纯抗体,无法除去体系中存在的白蛋白和巨球蛋白。目前这一问题已经通过基因修饰的方法表达Protein G得以解决。

Protein L与蛋白A和蛋白G结合到(抗体)的Fc区不同的是,蛋白L通过轻链相互作用结合抗体。因为重链的任何部分都不会参与结合相互作用,蛋白L结合更宽范围的抗体类大于蛋白A或G蛋白,Protein L结合所有抗体类,包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。Protein L蛋白结合仅限于那些含有κ轻链的抗体,Protein L结合人的κI,III,IV和小鼠的κI 轻链亚型;Protein L还可以结合单链抗体和Fab片段。 

物种

亚类

Protein A 结合

Protein G 结合

Protein L 结合

lgG(常规)

+++++

++++

++++

lgG1

+++++

++++

++++

lgG2

+++++

++++

++++

lgG3

-

++++

++++

lgG4

++++

++++

++++

lgM

-

-

++++

lgA

-

-

++++

lgE

-

-

++++

lgD

-

-

++++

Fab

++

++

++++

κ轻链

-

-

++++

L轻链

-

-

-

ScFv

++

-

++++

鸡蛋黄

lgY

-

-

-

IgG

-

+

++

lgG

++

++++

-

lgG

++++

++++

+

山羊

lgG

+/-

++

-

豚鼠

lgG1

+++

++

++

lgG2

+++

++

++

仓鼠

lgG 

+

++

+++

lgG

+

++

++++

考拉

lgG 

-

+

+

骆驼


-

+

+

猴(恒河)

 lgG

++++

++++

++++

小鼠

lgG1

+

++++

++++

lgG2a

++++

++++

++++

lgG2b

+++

+++

++++

lgG3

++

+++

++++

lgM

可变

-

++++

IgG

++

++++

+/-

IgG

++++

+++

+

大鼠

lgG1

-

+

++++

lgG2a

-

++++

++++

lgG2b

-

++

++++

lgG2c

+

++

++++

绵羊

lgG 

+/-

++

-

lgG

++++

-

N/A

具体步骤如下:

1. 血清预处理: 0.22孔径滤器过滤血清,与等体积PBS(pH7.4)混合,调至pH7.8,此时亲和挂柱效果较好。

2. 平衡亲和柱:用10倍体积的PBS(pH7.4)清洗柱子,同时将柱子下端与核酸蛋白检测仪进液口连接固定。

3. 上样:PBS平衡柱体时,调节核酸蛋白检测仪数值稳定在0左右,将样品加入上样柱床,核酸蛋白检测仪上数值慢慢升高,收集液体(此液体简称流穿液,流穿液中可能还会有未被柱子捕获的抗体,所以暂时收集以再次过柱纯化使用),

4. 上样完毕后,用PBS(pH7.2)洗杂蛋白,当核酸蛋白检测仪的数值下降到平衡数值,不再下降时,停止收集流穿液。

5. 抗体洗脱:当核酸蛋白检测仪的数值保持较低数值并稳定时,待柱床液面快流干时,轻轻在柱床上加入洗脱液(0.1M Gly-HCl,pH2.7),尽量不要冲起柱床;当核酸蛋白检测仪上数值迅速升高时,迅速顺次分管承接洗脱的液体,并迅速用中和液(0.5M Tris-Cl,pH8.0)中和,承接时宜多管顺次接取,并记录顺序。

6. 洗脱完毕后,当数值变低并不再变动时,用至少5倍柱床体积的PBS以 2~4 ml/min流速清洗平衡柱子。

7. 柱床用保存液(含20%乙醇的PBS)保存,并封闭柱子上下两端,4 ℃保存。

8. 抗体对PBS(pH7.2)透析3次,每次4h以上。

9. 测抗体浓度,并通过SDS-PAGE分析抗体纯度。

货号

产品名称

规格

产品描述

IGP0011

Frdbio   rProtein A beads

5ml/25ml/100ml

结合能力:>40mg Human   IgG/ml填料

IGP0012

Frdbio   rProtein G beads

5ml/25ml/100ml

结合能力:>30mg Human   IgG/ml填料

IGP0013

Frdbio   rProtein A/G beads

5ml/25ml/100ml

结合能力:>30mg Human   IgG/ml填料

IGP0014

Frdbio   rProtein L beads

5ml/25ml/200ml

结合能力:>15mg Human   IgG/ml填料


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