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重组蛋白表达——可溶性表达

重组蛋白表达——可溶性表达

 

1.表达工程菌

 蛋白可溶性表达很大原因取决于二硫键和正确折叠的问题,所以选用利于二硫键形成的宿主菌,如Origami(DE3), Origami B(DE3),Rosetta Origami(DE3) 等更利于蛋白表达。

2.促溶标签

 前文的列表中已经详细列出,并简要介绍功能特点,值得注意的是选用促溶标签时,一定要考虑载体情况和表达工程菌的配合,如Trx标签主要是促进二硫键的配对,必须配合Origami(DE3)之类的工程菌使用,如果使用BL21(DE3)通常不会使目标蛋白的可溶性得到改善。

3.分子伴侣表达

 在表达工程菌内同时装入一个表达伴侣蛋白的表达质粒,表达伴侣蛋白的质粒必须与表达外源蛋白的质粒避免“质粒不相容性”。目前,常用于大肠杆菌表达的分子伴侣主要是DNak(DnaJ,GrpE)和GroEL(GroES)等,科研人员可根据自己的实验需要构建合适的分子伴侣质粒,含分子伴侣质粒的感受态细胞已经有商业化的产品BL21(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2、pTf16)系列,实验人员可以根据具体情况选购。

4.启动子选择

 载体的启动子对于可溶性表达影响至关重要,pET系列的 T7/T7 lac为强启动子,强启动子在提高蛋白产量的同时也增强了包涵体的形成,如果遇到此种情况可以考虑换用弱启动子的载体,如pGEX系列,还可选择含cspA启动子的pCold系列载体。

5.分泌性表达

将外源目标蛋白分泌表达到培养基中,实现这个功能需要将原核蛋白信号肽序列加到外源蛋白的上游即可;目前,福因德生物已经开发出pFRD-pelB系列载体,可以帮助实现在大肠杆菌中分泌表达。

6.培养条件的优化

最常用的优化条件为:诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间;还可以优化培养基的营养成分和离子物质,比如,我们使用营养成分稍低的LB培养基,可同时向培养基中添加葡萄糖,镁离子、氯化钠、硫酸铵等盐离子。

6.1 低温诱导:比如20℃,低温情况下,转录和翻译变慢,蛋白质浓度低,有更多的时间正确折叠;

6.2 向培养基中加入0.4M蔗糖,高渗引起了渗透性休克反应,该反应增加了细胞内谷氨酸、脯氨酸和海藻糖的水平,为蛋白的正确折叠提供了环境;

6.3 42℃短暂热休克,然后降温到20℃:热休克增加了DnaK/J和GroEL/ES的水平,通常的程序是37℃培养到A600nm=0.5,然后快速升温到42℃维持15min左右,然后降到20℃并诱导蛋白的表达。

6.4 自诱导培养基,适合于T7启动子系列的诱导表达,当工程菌增长到一定密度后,自己缓慢开启诱导开关,缓慢诱导蛋白表达,利于蛋白正确折叠,便于可溶性表达。

货号

产品名称

规格

产品描述

PER0011

FrdbioR 自诱导培养基

500ml

T7启动子原核表达自诱导表达,优化可溶性表达。

PER0011S

FrdbioR 50×自诱导培养基添加剂

100ml

T7启动子原核表达自诱导表达,优化可溶性表达。

PER0021

FrdbioRpG-KJE8伴侣蛋白质粒

50ng

协助蛋白正确折叠,优化可溶性表达。

PER0022

FrdbioRpGro7伴侣蛋白质粒

50ng

协助蛋白正确折叠,优化可溶性表达。

PER0023

FrdbioRpKJE7伴侣蛋白质粒

50ng

协助蛋白正确折叠,优化可溶性表达。

PER0024

FrdbioRpG-Tf2伴侣蛋白质粒

50ng

协助蛋白正确折叠,优化可溶性表达。

PER0025

FrdbioRpTf16伴侣蛋白质粒

50ng

协助蛋白正确折叠,优化可溶性表达。

PEV0031

pFRD-pelB

50ng

原核分泌型表达载体

服务编号

服务名称

服务描述

PES0030

大肠杆菌重组蛋白表达

从客户提供的材料信息开始进行重组蛋白原核表达。

PES0031

大肠杆菌重组蛋白可溶性表达

从客户提供的材料信息开始进行重组蛋白原核上清可溶性表达。