Ni-NTA层析柱亲和纯化组氨酸（6His）标签融合蛋白
1. 样品制备
1.1 样品制备1: 细菌或酵母胞内表达的蛋白
1.1.1 将诱导表达结束后的培养物转移到离心管中，８,000rpm，离心15min收集菌体，然后加入1/10体积的裂解缓冲液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM imidazole ，pH 8.0，1mM PMSF) ，加入0.2～0.4mg/ml溶菌酶。
（PMSF很容易降解,在破菌前加入,同时还可加入不影响目的蛋白与树脂结合的蛋白酶抑制剂。）
1.1.2 将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，也可考虑加入10μg/ml RNase A和5μg/ml DNase I），混匀，放置于冰上，然后冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
1.1.3 将澄清的破碎液转移至离心管中，10,000rpm下，4℃离心20～30min，取上清，置于冰上备用或-20℃保存。
1.2 样品制备２： 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白
将诱导表达结束的培养物转移到离心管中，８,000rpm，离心15min，收集上清。
如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等物质，即可直接上柱使用；
如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，需先用PBS 4℃下透析才可上柱；
大量体积的上清，需加入(NH4)2SO4沉淀浓缩，再用PBS 4℃透析后再上柱子。
2. 样品纯化
Ni-NTA亲和树脂灌装层析柱或直接使用预装柱，层析柱下端接核酸蛋白检测仪。
（所有溶液/样品液使用前建议离心或用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤后再上柱。）
2.1 用3～5倍柱床体积的去离子水冲洗掉层析柱树脂保护液。
2.2 使用至少5倍柱床体积的裂解缓冲液平衡层析柱。
2.3 经过滤的样品液上柱，并收集层析柱下端流出的液体（流穿液）。
利用泵或注射器上样，如果是重力柱也可直接用移液器上样。
2.4 用洗杂缓冲液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，20 mM imidazole，pH 8.0）冲洗柱子，直到核酸蛋白检测仪数值达到一个稳定的基线；至少需要10～15个柱床体积洗杂缓冲液。
在裂解缓冲液和洗杂缓冲液中加入低浓度咪唑（imidazole）可以提高纯化蛋白的纯度。
2.5 用洗脱液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，250 mM imidazole，pH 8.0）采用一步法或线性梯度洗脱液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，20～300 mM imidazole，pH 8.0）梯度洗脱。洗脱的过程中顺次分管接收洗脱蛋白并分别做上标记。
（一步法洗脱中，通常5倍柱床体积洗脱液可彻底洗脱；梯度洗脱中，通常需要20倍柱床体积或更多洗脱液分离不同结合强度的蛋白质。）
3. SDS-PAGE检测分析纯化过程各组分
纯化过程中得到的样品（包括上样前样品液、流穿液、洗杂液和顺次收集的洗脱蛋白）以及原始样品使用SDS-PAGE检测分析纯化效果。
4. 填料再生与保存
组氨酸标签蛋白亲和纯化填料所带的Ni2+不需要经常螯合去除和重新挂Ni2+。当填料使用过程中发现反压过高，填料上面出现明显的污染，或者填料载量明显变低时，需要进行对填料进行Ni2+剥离和重新挂Ni2+，也就是填料再生。将填料装填在合适的层析柱内，按照下面操作流程进行Ni2+剥离和重新挂Ni2+。
4.1 使用0.2 M 醋酸溶液（含 6 M 盐酸胍）清洗2倍柱床体积。
4.2 使用去离子水清洗5倍柱床体积。
4.3 使用2% SDS 清洗3倍柱床体积。
4.4 使用去离子水清洗5倍柱床体积。
4.5 使用乙醇清洗5倍柱床体积。
4.6 使用去离子水清洗5倍柱床体积。
4.7 使用100 mM EDTA (pH 8.0)清洗5倍柱床体积。
4.8 使用去离子水清洗5倍柱床体积。
4.9 使用100 mM NiSO4清洗5倍柱床体积。
4.10 使用去离子水清洗10倍柱床体积。
填料再生后，可以立即使用，也可以保存在20%的乙醇中，置于4℃保存。
5. 填料上残留污染物的去除：建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
5.1 去除强疏水结合的蛋白、脂蛋白和脂类
通过使用30%异丙醇清洗5～10个柱床体积，接触时间为15-20min可以去除此类污染物。然后，再使用10倍柱床体积的去离子水清洗。也可以选择使用含有去污剂的酸性或碱性溶液，2倍柱床体积清洗填料。例如，含有0.1–0.5% 非离子去污剂的0.1 M 醋酸溶液，接触时间为1～2 h。去污剂处理后，需要使用70%的乙醇清洗5个柱床体积，以彻底去除去污剂。最后使用10倍柱床体积的去离子水清洗。
5.2 去除离子作用结合的蛋白
使用1.5M NaCl溶液浸泡柱床填料10～15min后，流出浸泡液，再使用去离子水清洗10个柱床体积。
6. 问题及解决方案
问题 | 原因分析 | 推荐解决方案 |
柱子反压过高 | 填料被堵塞 | 裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜（0.22 or 0.45 μm）过滤，或者离心去除。 |
样品中含有高浓度的核酸，加长破碎时间直至粘度降低，或者添加DNase I （终浓度5 μg/ml），Mg2+ （终浓度 1 mM），冰上孵育10-15min。 | ||
样品太粘稠 | 有机溶剂或者蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。 | |
洗脱组分中没有目的蛋白 | 蛋白可能是包涵体，没有在上清中 | 可以通过电泳检测裂解液分析上清中是否含有目的蛋白，包涵体蛋白需要按照包涵体蛋白的纯化方式。 |
表达量太低 | 优化表达条件。 | |
目的蛋白结合比较弱，在洗杂步骤被洗下来了 | 提高洗杂缓冲液的pH，或者降低咪唑浓度。 | |
目的蛋白结合过强，不容易洗脱下来 | 降低洗脱缓冲液r的pH值，或者增加洗脱缓冲液中咪唑浓度。 | |
使用10～100mM EDTA溶液剥离镍离子，同时得到目的蛋白。 | ||
蛋白降解 | 菌体破碎时添加一些蛋白酶抑制剂。在4℃下进行纯化操作。 | |
洗脱组分不纯（含有多种蛋白） | 洗杂不彻底 | 增加洗杂缓冲液体积。 |
样品中含有其他的组氨酸标签蛋白 | 通过调节pH值，或者咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他的纯化手段（如离子交换，疏水等）进一步纯化洗脱组分。 | |
填料呈现褐色 | 缓冲液中含有DTT等还原剂 | 适当降低还原剂DTT的浓度，或者改用巯基乙醇。 |
上样过程中蛋白发生沉淀 | 操作温度太低 | 室温下进行上样。 |
蛋白发生聚集 | 在样品和所有的缓冲液中添加稳定剂，如0.1%的Triton X-100 或者Tween-20。 |
