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多肽与载体偶联的三种不同方式

多肽与载体偶联的三种不同方式

 

一、Frdbio–SH介导多肽与载体偶联

1.  cKLH载体蛋白与sulfo-SMCC的偶联 (以偶联20mg多肽为例,根据实验实际偶联量,所有试剂体积作同比缩放)

1.1 称取20mg  cKLH(Frdbio,Cat No.: BCJ0002),溶于2ml超纯水,配成【10 mg/ml cKLH溶液】。

1.2 称取10 mg Sulfo-SMCC(Frdbio)于2ml超纯水配成【5mg/ml Sulfo-SMCC溶液】。

1.3 将以上两种溶液等体积混匀,室温(25℃)反应60 min或者37℃反应30 min,磁力搅拌器慢速均匀搅动反应,避免产生气泡。

1.4 反应完后将以上反应溶液装入10kD透析袋,在PBS(pH7.2)溶液中透析除去过多Sulfo-SMCC,每隔3h换液,至少换3~4次,确保透析完全,即为【活化的cKLH载体】(有条件的也可以用sephdex-G25分子筛色谱分离或超滤管。活化的cKLH要尽快使用,不可久放。)

2. 多肽的偶联

偶联前需检测多肽中-SH活性。

2.1 Ellman试剂法检测多肽-SH状态:

方法:在96孔酶标板中,10μl多肽+100μl Ellman试剂,用分光光度计在96孔酶标板中412nm进行测量, OD>0.15时,多肽SH正常,如果OD<0.15,说明多肽被氧化或者自我交联,不可使用。偶联完成之后,透析前用上述同样方法检测DO<0.03时,说明多肽已经80%以上全部偶联,可继续添加多肽;如果OD>0.03,说明多肽过量未全部偶联。如果没有Nano分光光度计,直接观察颜色,颜色变黄,说明游离—SH过量。

2.2 称取20mg多肽溶解于5ml交联缓冲液(0.1M PB,0.15M NaCl)中,配成【4mg/ml的多肽溶液】(对于难溶肽,可用≤30%的DMSO溶解),一般我们只偶联5~10mg多肽,等比例缩小体积即可。

2.3 将第1.4步透析好的cKLH与第5步配好的【4mg/ml多肽溶液】混合,室温(25℃)4h。(此处可检测多肽是否偶联充分,检测方法见2.1 Ellman试剂法检测多肽-SH状态)

2.4 最后用10kD的透析袋于PBS(pH7.2)中透析除去游离未偶联的多肽,至少换液4次。每次2h,磁力搅拌器上搅拌透析,调整到合适浓度分装成小管,-20℃保存。

3.Ellman试剂检测多肽-SH状态评估载体与多肽偶联效率

方法见“2.1 Ellman试剂法检测多肽-SH状态”。

二、Frdbio EDC或EDC/NHS介导多肽与载体偶联

1. 将载体蛋白cKLH(Frdbio,Cat No.: BCJ0002) 溶解在偶联缓冲液(0.1M MES,pH4.7),终浓度10mg/ml。

2. 将待偶联多肽溶解在偶联缓冲液(0.1M MES,pH4.7),终浓度4mg/ml。

3. 将步骤1)和步骤2)的溶液混合,多肽与载体蛋白摩尔比为10:1。

4. 将EDC试剂(Frdbio)溶解在偶联缓冲液(0.1M MES,pH4.7)中配制成1M EDC溶液。

5. 步骤3的混合液在磁力搅拌下,缓慢滴加步骤4)的EDC溶液(EDC滴加的摩尔量与多肽相同),置25℃磁力搅拌反应2h。

(如果此过程中,产生沉淀应该减少EDC的用量直到得到可溶性溶液为止。)

6. 透析或凝胶过滤去除未偶联的多肽和EDC试剂,并置换成PBS溶液(0.01M PBS,pH7.4)。

(NHS与EDC可以显著提高偶联效率,如果采用此方案,只需要在步骤5)中加入NHS至终浓度为5mM即可。)

三、Frdbio GA( Glutaraldehyde,戊二醛)介导多肽与载体偶联

1. 将含氨基的载体蛋白溶解在偶联缓冲液(0.1M 碳酸盐,0.15M NaCl,pH8.5),终浓度2mg/ml。

2. 将待偶联多肽溶解在步骤1)的溶液中,终浓度2mg/ml左右,多肽与载体蛋白摩尔比例20:1~40:1最好。

3. 在上述溶液中加入新鲜GA至中浓度为1%,4℃磁力搅拌器上反应2~4h。

(戊二醛最好在通风橱操作,避免接触皮肤和眼睛。)

4. 反应完毕,在上述溶液溶液中加入硼氢化钠至终浓度为10mg/ml, 4℃磁力搅拌器上反应1h。

5. 透析或凝胶过滤去除未偶联的多肽和GA试剂,并置换成PBS溶液(0.01M PBS,pH7.4)。

货号

产品名称

规格

产品描述

BCJ0010

-NH2 linking   kit

5T/10T/50T

蛋白/多肽或者化合物都通过氨基偶联,非定向偶联

BCJ0020

-SH  Linking kit

5T/10T/50T

蛋白/多肽或者化合物通过-SH与-NH2偶联,效率高。

BCJ0030

-COOH &-NH2 Linkling   kit

5T/10T/50T

介导蛋白/多肽或者化合物通过-COOH &-NH2偶联。

BCJ0030S

-COOH &-NH2   SuperLinkling kit

5T/10T/50T

介导蛋白/多肽或者化合物通过-COOH &-NH2偶联,效率更高。

BCJ0110

GA(Glutaraldehyde)linking   Reagent

10mg/50mg/100mg

同双功能交联剂(-NH2)

BCJ0120

Sulfo-SMCC  Linking Reagent

10mg/50mg/100mg

异双功能交联剂(-SH &-NH2)

BCJ0130

EDC.HCl Linkling Reagent

10mg/50mg/100mg

异双功能交联剂(-COOH &-NH2)

BCJ0140

NHS SuperLinkling Reagent

10mg/50mg/100mg

异双功能交联剂辅助试剂(-COOH &-NH2)

BCJ0001

BSA carrier

10mg/50mg/100mg

多肽偶联专用载体。

BCJ0001s

cBSA carrier

10mg/50mg/100mg

经过修饰,离子化多肽偶联专用载体,氨基更多。

BCJ0002

KLH carrier

10mg/50mg/100mg

多肽偶联专用载体,分子量大,更利于多肽抗体制备。

BCJ0002S

cKLH carrier

10mg/50mg/100mg

经过修饰, 离子化多肽偶联专用载体,氨基更多。

BCJ0003

OVA carrier

10mg/50mg/100mg

多肽偶联专用载体。

BCJ0004

Polyk carrier

10mg/50mg/100mg

多聚有机化合物多肽偶联专用载体。

服务编号

服务名称

服务描述

PSS0011

多肽合成

固相多肽合成,纯度最高99.5%,最长可合成70个氨基酸。

PSS0012

多肽修饰

可修饰FITC,Biotin,乙酰化,甲基化,磷酸化等。

PSS0021

多肽偶联蛋白载体

将多肽偶联到载体上制备完全抗原或者检测原,常用载体BSA,KLH,OVA等。

BCS0010

多肽载体偶联

多肽偶联到载体制备完全抗原,平均每个载体偶联5~10个多肽。

BCS0010S

多肽多聚支架偶联

多肽偶联到载体制备完全抗原,平均每个载体偶联20~100个多肽。