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产品分类
Protein A Agorase Beads
Protein A Agorase Beads
物品单位 品牌
Frdbio
  • 产地:中国
  • 货号:IGP0011
  • 发布日期: 2020-08-28
  • 更新日期: 2020-08-28
产品详细说明
产地 中国
品牌 Frdbio
货号 IGP0011
用途范围
纯度 %
CAS编号
规格 ml
是否进口

一. 产品介绍

Protein A Agorase Beads 是用于分离和纯化单克隆抗体的亲和层析介质,具体性能见表1。Protein A 是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白,主要通过Fc 片段结合哺乳动物IgG。Protein A Agorase Beads 的配体蛋白Protein A 是在天然蛋白A 的基础上进行生物工程突变得到的一种耐碱蛋白A(Alkaline tolerate,故缩写为At)。

该产品以0.1M NaOH 进行200 次在位清洗,介质载量几乎不变,以0.5M NaOH 进行100 次在位清洗,载量仍可达到最初载量的80%,更加方便客户尤其是工业客户的清洗操作。该产品采用较稳定的定向偶联,脱落量低(小于10ng/mg IgG,见图1)。

Protein A Agorase Beads 是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质,可以在相对较高的流速下进行单克隆抗体和多克隆抗体的纯化,其耐压性能见图2,因此Protein A Agorase Beads 适用于工业化抗体的大规模生产。

表1. Protein A Agorase Beads 产品性能

项目

性能

介质

高度交联的4%琼脂糖

平均粒径

~90μm

配体

耐碱性Protein A

结合载量

> 40 mg 人lgG/ml 介质

化学稳定性

可耐受抗体纯化过程中的所有试剂

工作pH

3-12

在线清洗

0.1-0.5M NaOH

线性流速

50-300cm/h

保存

20% 乙醇, 2℃ - 8℃

 

                图1. CIP 清洗后Protein At 脱落量

 

 

 

 

    图2.介质的压力/流速曲线(层析柱BPG300,柱高20cm)

二. 纯化流程

1. Buffer 的准备

所用水和Buffer 在使用之前建议用0.22μm 或0.45μm 滤膜过滤。

结合缓冲液/洗涤缓冲液:0.15 M 氯化钠、20 mM 磷酸氢二钠,pH7.0

洗脱液:0.1 M 甘氨酸,pH 3.0

中和液:1 M Tris-HCl 缓冲液,pH 8.5 。

2.样品准备

上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH 值,可以用结合/洗涤缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释,或者样品用结合/洗涤缓冲液透析。样品在上样前建议离心或用0.22μm 或0.45μm 滤膜过滤,减少杂质,提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

3. Protein A Agorase Beads 装填

Protein A Agorase Beads 被广泛应用于工业纯化,因此,涉及到各种中压色谱层析柱的填装,下面介绍使用Protein A Agorase Beads 填装层析柱的方法。

层析柱的装填(使用储液器装填)

1). 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头,确保柱底筛板上无气泡,关闭柱底出口,并在柱底部留出1-2cm 的去离子水。

2). 将树脂悬浮起来,小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。

3). 如果使用储液器,应立即在层析柱和储液器中加满水,将进样分配器放置于浆液表面,连接至泵上,避免在分配器或进样管中产生气泡。

4). 打开层析柱底部出口,开起泵,使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱,然后缓慢增加至最终流速,这样可避免液压对所形成柱床的冲击,也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速,可以用你所使用泵的*流速,这样也可以得到一个很好的装填效果。(注意:在随后的色谱程序中,不要超过*装柱流速的75%)当柱床高度稳定后,在*的装柱流速下至少再上3 倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。

5). 关闭泵,关闭层析柱出口。

6). 如果使用储液器,去除储液器,将分配器至于层析柱中。

7). 将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器,锁紧分配器接头。

8). 将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中,开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。

4.样品纯化

1). Protein A Agorase Beads 装入合适的层析柱,层析用5 倍柱体积的结合Buffer 进行平衡,使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下,起到保护蛋白的作用。

2). 将样品加到平衡好的Protein A Agorase Beads 中(保证目的蛋白与Protein A Beads4FF 充分接触,提高目的蛋白的回收率),收集流出液。

3). 用10-15 倍柱体积的洗杂Buffer 进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白,收集洗杂液。

4). 使用5-10 倍柱体积的洗脱Buffer,收集洗脱液,即目的蛋白组分。

5). 依次使用3 倍柱体积的结合Buffer 和5 倍柱体积的去离子水平衡填料,*再用5 倍柱体积的20%的乙醇平衡,然后保存在等体积的20%的乙醇中,置于4 度保存,防止填料被细菌污染。

注:*使用时,可先按照4 填料清洗中CIP 清洗一遍,避免脱落的配体残留。

5.SDS-PAGE 检测

将使用纯化产品得到的样品(包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分)以及原始样品使用SDS-PAGE 检测纯化效果。

三. 残留配体去除

Protein A Agorase Beads 配体的脱落很低,小于10ng/mg 抗体。但是很多产品需要完全去除,可采用阳离子交换、阴离子交换或凝胶过滤等方法去除,具体参照阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和凝胶过滤树脂的使用。

四. 填料清洗

Protein A Agorase Beads 可以重复使用而无需再生,但随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集,往往造成流速和结合载量都下降,严重影响柱子的性能,这时需要对树脂进行清洗。

Protein A Agorase Beads 是一种耐碱亲和介质,可以耐受0.1M-0.5M NaOH 溶液的清洗,成本低,效果好,具体操作:

1.3 倍柱体积的结合液;

2.至少2 倍柱体的0.1–0.5 M NaOH,接触时间为15 minutes;

3.5 倍柱体积的结合液冲洗。

:因0.1–0.5 M NaOH 粘度大易造成压力增加,可进行反向冲洗。

五. 问题及解决方案

问题

原因分析

推荐解决方案

柱子反压过高

筛板被堵塞

清洗或更换筛板

填料被堵塞

按照第4部分进行树脂CIP清洗

裂解液中含有微小的固体颗粒,建立上柱前过滤

样品纯化过程中曲线不稳

样品或buffer中有气泡

取出样品或柱子中的气泡

样品和buffer进行脱气

洗脱组分中没有目的蛋白

样品中抗体浓度太低

使用其抗原做配体的介质

抗体被降解

适当的提高洗脱Ph

回收率逐渐减低

上样量太多

减少上样量

柱子太脏

按照第4部分进行树脂CIP清洗