产地 | 中国 |
品牌 | Frdbio |
货号 | IGP0012 |
用途 | |
包装规格 | ml |
纯度 | % |
CAS编号 | |
是否进口 | 否 |
一. 产品介绍
rProtein G Beads 4FF是用于分离和纯化lgG的亲和层析介质,具体性能见表1。ProteinG是一种分离自G Streptococci的细胞壁蛋白,它可通过其Fc 片段结合哺乳动物IgG。重组protein G含有高亲和结合位点,减少了非特异性吸附。Protein G 和Protein A 有不同的lgG结合特性,相比Protein A, Protein G对牛、羊、马等多克隆抗体有更强的结合力,它还可以结合不能与Protein A 很好结合的大鼠lgG、人lgG3和小鼠lgG1。rProtein G Beads 4FF是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质,可以在相对较高的流速下进行单克隆抗体和多克隆抗体的纯化。
表1. rProtein G Beads 4FF产品性能
项目 | 性能 |
介质 | 高度交联的4%琼脂糖 |
平均粒径 | ~45-165 |
配体 | 重组蛋白G |
结合载量 | > 30 mg 人lgG/ml 介质 |
工作pH | 3-10 |
*压力 | 0.3MPa 3bar |
保存 | 20% 乙醇, 2℃ - 8℃ |
二. 纯化流程
1. Buffer 的准备
所用水和Buffer 在使用之前建议用0.22μm 或0.45μm 滤膜过滤。
结合缓冲液/洗涤缓冲液:0.15 M 氯化钠、20 mM 磷酸氢二钠,pH7.0
洗脱液:0.1 M 甘氨酸,pH 3.0
中和液:1 M Tris-HCl 缓冲液,pH 8.5 。
2. 样品准备
上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH 值,可以用结合/洗涤缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释,或者样品用结合/洗涤缓冲液透析。样品在上样前建议离心或用0.22μm 或0.45μm 滤膜过滤,减少杂质,提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
3.rProtein G Beads 4FF装填
rProtein G Beads 4FF被广泛应用于工业纯化,因此,涉及到各种中压色谱层析柱的填装,下面介绍使用rProtein G Beads 4FF填装层析柱的方法。
层析柱的装填(使用储液器装填)
1)用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头,确保柱底筛板上无气泡,关闭柱底出口,并在柱底部留出1-2cm的去离子水。
2)将树脂悬浮起来,小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
3)如果使用储液器,应立即在层析柱和储液器中加满水,将进样分配器放置于浆液表面,连接至泵上,避免在分配器或进样管中产生气泡。
4)打开层析柱底部出口,开起泵,使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱,然后缓慢增加至最终流速,这样可避免液压对所形成柱床的冲击,也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速,可以用你所使用泵的*流速,这样也可以得到一个很好的装填效果。(注意:在随后的色谱程序中,不要超过*装柱流速的75%)当柱床高度稳定后,在*的装柱流速下至少再上3 倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。
5)关闭泵,关闭层析柱出口。
6)如果使用储液器,去除储液器,将分配器至于层析柱中。
7)将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器,锁紧分配器接头。
8)将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中,开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。
4.样品纯化
1) 将rProtein G Beads 4FF装入合适的层析柱,层析用5 倍柱体积的结合液进行平衡,使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下,起到保护蛋白的作用。
2) 将样品加到平衡好的rProtein G Beads 4FF中(保证目的蛋白与rProtein G Beads4FF充分接触,提高目的蛋白的回收率),收集流出液。
3) 用10-15倍柱体积的洗杂液进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白,收集洗杂液。
4) 使用5-10倍柱体积的洗脱液,收集洗脱液,即目的蛋白组分。
5) 依次使用3 倍柱体积的结合液和5 倍柱体积的去离子水平衡填料,*再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡,然后保存在等体积的20%的乙醇中,置于4度保存,防止填料被细菌污染。
5.SDS-PAGE 检测
将使用纯化产品得到的样品(包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分)以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
三. 填料清洗
rProtein G Beads 4FF可以重复使用而无需再生,但随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集,往往造成流速和结合载量都下降,严重影响柱子的性能,这时需要对树脂进行清洗。去除一些沉淀或变性物质用 2倍柱体积的6M盐酸胍溶液进行清洗,然后立即用5 倍柱体积的PBS, pH 7.4 清洗。去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质用 3-4倍柱体积的70%乙醇或2 倍柱体积的1% Triton™ X-100 清洗,然后然后立即用5倍柱体积的PBS, pH 7.4清洗。
去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
用 3-4倍柱体积的70%乙醇或2 倍柱体积的1% Triton™ X-100 清洗,然后然后立即用5倍柱体积的PBS, pH 7.4清洗。
四. 问题及解决方案
问题 | 原因分析 | 推荐解决方案 |
柱子反压过高 | 筛板被堵塞 | 清洗或更换筛板 |
填料被堵塞 | 按照第3部分进行树脂CIP清洗 | |
裂解液中含有微小的固体颗粒,建立上柱前过滤 | ||
样品纯化过程中曲线不稳 | 样品或buffer中有气泡 | 取出样品或柱子中的气泡 |
样品和buffer进行脱气 | ||
洗脱组分中没有目的蛋白 | 样品中抗体浓度太低 | 使用其抗原做配体的介质 |
抗体被降解 | 适当的提高洗脱Ph | |
回收率逐渐减低 | 上样量太多 | 减少上样量 |
柱子太脏 | 按照第3部分进行树脂CIP清洗 |