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Frdbio® HABA法生物素标记效率检测试剂盒
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  • 发布日期: 2021-02-26
  • 更新日期: 2021-02-26
产品详细说明
用途范围: 纯度: %
CAS编号: 产地: 中国
品牌: Frdbio 规格: T
货号: ARL0021T1 是否进口:

产品介绍:

2- 4-羟基苯偶氮)苯甲酸(2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid ,英文缩写HABA)可以与亲和素特异性结合,其结合复合物为一种黄色或者橘黄色,在500nm有*吸光值;但是其结合力远远低于生物素与亲和素的结合,当溶液中存在生物素的时候,生物素会强竞争让HABA解离下来,引起吸光值下降。基于此原理,可以根据500nm吸光值的变化计算出蛋白标记生物素的量(被标记蛋白与生物素的摩尔比)。

生物素标记摩尔比的计算是基于比尔-朗伯定律(Beer–Lambert law),又称比尔定律或比耳定律(Beer's law),是分光光度法的基本定律,即当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度(AbsorbanceA)与吸光物质的浓度(ConsenreationC)及吸收层厚度(lengthL)成正比用公式表示为:A = ε*C* L其中A为光度,ε为摩尔吸光系数,所以此处公式为500= ε500 C L(此处ε500=34,000M-1cm-1

主要组分:

组分名称(Components 数量 组分说明
HABA溶液  1mL 10mM in 0.01M NaOH
超纯亲和素(Avidin) 10mg
PBS(pH7.2) 30mL 100mM 磷酸钠,150mM NaCl

        

储存条件:

该试剂盒在低温下运输,收到后请置于2-8℃保存,保存时间2年以上。


实验前准备:

HABA- Avidin混合液配制:5mg Avidin300uL 10mM HABA加入到9.7ml PBS溶液中,(合格标准:1cm比色皿A500=0.9 ~ 1.3)配置好的混合液可以在4℃保存,2周内可以正常使用,如果发现有沉淀或者絮状物,请过滤或者离心后使用。

 

实验操作可以选择分光光度法或微孔酶标板法:

分光光度法:

A. 900uL HABA- Avidin混合液放入1cm光程比色杯,在500nm波长测量吸光值,记录为A500(H-A);*测量三次取平均值;

B. 在比色杯中加入100uL待测的生物素标记蛋白(Biotinylated Protein,简称BP),充分混匀后,在500nm波长测量吸光值,吸光值稳定20秒以上,记录为A500(H-A-BP);*测量三次取平均值;如果A500(H-A-BP)<0.35,请稀释待测样品,再次重复此步骤。

 

微孔酶标板法:

A.     180uL HABA- Avidin混合液放入微孔板中,在500nm波长测量吸光值,记录为A500(H-A);*测量三次取平均值;

B.      在微孔板中加入20uL待测的生物素标记蛋白(Biotinylated Protein,简称BP),震荡或移液器吹打充分混匀后,在500nm波长测量吸光值,吸光值稳定20秒以上,记录为A500(H-A-BP);*测量三次取平均值;如果A500(H-A-BP)< 0.3*A500(H-A),请稀释待测样品,再次重复此步骤。

 

 

标记效率计算方法:

1)蛋白摩尔浓度计算:

  image.png

2a)吸光值变化(分光光度比色皿)ΔA500=0.9* A500(H-A)- A500(H-A-BP)

2b)吸光值变化(微孔酶标板)ΔA500=A500(H-A)- A500(H-A-BP)

3a)生物素摩尔浓度计算(分光光度计法)

 image.png

3b)生物素摩尔浓度计算(微孔板法):

image.png

备注:使用标准96孔微孔板,200ul液体,其液面高度(光程)为0.58cm

 

标记摩尔比计算:

生物素:蛋白=[(生物素摩尔浓度*10)/蛋白原始摩尔浓度]*稀释倍数

*本试剂仅供实验室研究使用*


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