背景介绍

cAMP和cGMP都是小分子的环状核苷酸，以微量存在于动植物细胞和微生物中，被称其为细胞内的*信使（激素为*信使）。

cAMP（或cGMP）由腺苷酸（或鸟苷酸）环化酶产生，被磷酸二酯酶降解，因此激活腺苷酸（或鸟苷酸）环化酶或者抑制磷酸二酯酶，可以提高细胞内cAMP（或cGMP）的含量。研究发现，cAMP（或cGMP）特异性磷酸二酯酶的抑制剂可用于人类疾病的治疗。如：增强β肾上腺素能受体（cAMP的封闭剂）已被用于心率失调、高血压、心肌梗死等心脏疾病；cAMP特异性磷酸二酯酶2/4的抑制剂正在进行认知增强方面的临床测试；而cGMP特异性磷酸二酯酶类型5可用于治疗ED等疾病。

在五十年的研究历程中，从开始研究cAMP，cGMP在各种生理过程中的调节作用，到近几年与之相关的药物研发，药物筛选领域，人们一直在努力寻找一种快速、灵敏、特异性和可重复地定量检测cAMP和cGMP含量的方法。

cAMP，cGMP分子量分别只有329.21和345.21，在机体内的含量极低，为pmol/L级别，用一般的分析方法无法测定。70年代一系列测定cAMP和cGMP的方法被发明出来，最基本的原理有三种：分别是竞争性蛋白质结合分析法、放射性免疫分析法和薄层色谱法。

本试剂盒利用竞争酶联免疫分析方法来测定细胞提取物或体外腺苷酸环化酶实验中的cGMP的水平。包被羊抗鼠多克隆抗体在酶标板上，细胞提取物或体外腺苷酸环化酶实验中的cGMP与固定数量的标记辣根过氧化物酶的cGMP竞争性的结合抗cGMP单克隆抗体，采用已知浓度的cGMP标准品来做标准曲线。检测450nm波长下的OD值，吸光度OD值与样品中cGMP的浓度呈反比关系。基于cGMP标准品所得曲线，通过测得的OD值可以计算出样品中cGMP的浓度，本试剂盒IC50（50% B/B0）约5 pmol/mL，检测限约0.1 pmol/mL。

试剂盒组成

所需材料

酶标仪（检测波长450 nm，参比波长630nm）

加样枪

EP管

孔板振荡器

吸水纸

去离子水

样本处理

组织样本：新鲜收集的组织样本必须立即冻存在液氮中。使用前去除冰冻样本称重，加入5-10倍体积的0.1M HCl。用匀浆器在冰上匀浆。然后室温离心5min（＞600 g）。留上清，可以直接实验，或用0.1M HCl稀释。

细胞样本：去除培养基，加入适量0.1M HCl（在0.1M HCl中加入0.1%~1% Triton X-100可增强细胞的溶解效果），放置10min，期间观察以确认细胞是否发生溶解。如果溶解不充分，可以再增加10min，直至细胞完全溶解。室温离心5min（600 g）。留上清，用于本试剂盒检测。注：上述浓度的Triton X-100不会影响样品与板的结合，但可能会增加背景值，建议用含相同浓度Triton X-100稀释标准品，以去除误差。

尿液、血浆和培养液：每ml样品中加入10μl浓盐酸（12M），混匀后，室温离心5min（600 g），留上清，用于本试剂盒检测。血浆、血清、全血和组织匀浆通常含有磷酸二酯酶（phosphodiesterases）和大量免疫球蛋白（Ig），它们会干扰实验。用0.1 M HCl处理样品，可以灭活磷酸二酯酶和降低免疫球蛋白的浓度，使之可以用于本试剂盒。磷酸二酯酶和免疫球蛋白也可以通过加入2% TCA（三*）使之沉淀或用截留分子量10 KD的超滤离心管去除。

注意事项

1.    本试剂盒所有相关试剂均预先平衡至室温（20-25℃）。

2.    各孔分别加入标准品和样品。

3.    沿孔壁加入各试剂，避免交叉污染。

4.    本试剂盒提供的是可分拆的孔板条，使用者可以按照样品数量选择使用量。未用的孔板请放回原封口袋，保存在4℃。孔板请放在本试剂盒配送的孔板架上使用。

5.    加入底物前，请确保孔中没有残余液体。

6.    终止液具有腐蚀性，请小心使用。

试剂准备

1.    cGMP标准品溶液
取8个新EP管，分别标记1-8#。在1#管中加入990 μl 0.1M HCl，2-8#管中分别加500 μl 0.1M HCl。加入10μl 标准品（10000 pmol/mL）到1#管中，剧烈振荡。从1#管中取去500μl加入2#管，剧烈振荡。同样方法完成3-8#管的稀释（1-8#管cGMP浓度分别是100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78pmol/ml）。稀释好的标准品建议在15min内使用。另外，标记一个新EP管为B0（maximum binding，0pmol/ml），加入500μl 0.1M HCl。2.    “Assay Buffer工作液”的准备

将本试剂盒的Assay Buffer（10×）（15 ml） 加入135 ml去离子水中。
注：配好的Assay Buffer工作液可室温保存3个月（但不能超出试剂盒的保质期）

3.    “cGMP-HRP Conjugate工作液”的准备
用配好的Assay Buffer工作液按1:1000 将cGMP-HRP Conjugate（1000×）稀释至工作液。

实验步骤

注：所有标准品管包括B0管以及样品管均要加入相同体积的Neutralizing Buffer，并立即振荡2sec.

1.    每个孔中加入50 μl Neutralizing Buffer。TA （Total Activity）和空白孔除外。

2.    加50 μl 0.1M HCl至NSB孔（Non-Specific Binding）和B0孔。

3.    分别取50 μl各浓度标准品溶液至相应孔中。.

4.    取50 μl样品溶液至相应孔中。

5.    各取50 μl Assay Buffer工作液至NSB孔中。

6.    取50 μl cGMP-HRP Conjugate工作液至各孔中（TA和空白孔不加）。

7.    取50 μl Anti-cGMP monoclonal antibody至各孔中（TA、空白和NSB孔不加）。

8.    室温孵育2 h，倒空，用Assay Buffer工作液洗4遍，每次拍干。

9.    加入5 μl 稀释20倍的cGMP-HRP Conjugate工作液至TA孔中。

10.  取150 μl TMB Substrate至各孔中，室温静置10min左右。 

11.  加50 μl Stop Solution至各孔中，并立即上酶标仪读数检测波长为450nm，参比波长为630nm）。扣除每个读数的Blank（空白）孔光密度值。

Blank: only contains substrate.

TA: Total activity, contains cGMP-HRP conjugate (5μl) and substrate.

NSB: Non-specific binding, contains neutralizing buffer, cGMP-HRP conjugate and substrate.

B0: 0 pg/mL standard, contains neutralizing buffer, cGMP-HRP conjugate, Anti-cGMP monoclonal antibody and substrate. 

S1-S8: Standards 1-8       

SP1-SP72: samples

结果计算

1.    样品和标准品的净OD平均值的计算：

净OD平均值=OD平均值-NSB孔OD平均值

2.    结合率（各浓度标准品的结合率占*结合率（B0孔）的百分比）计算：
结合率（B/B0）=（净OD平均值/B0孔OD平均值）×100

3.    用软件（如Curve Expert或ELISA Calc）进行结合率（或净OD平均值）对Log（cGMP标准品浓度）的三次多项式回归曲线拟合（three order polynomial linear regression curve）或指数Logistic曲线拟合。

4.    通过样品的结合率即可计算样品中cGMP浓度。