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抗体的标记——生物素(Biotin)

 

一般每个抗体可以标记3~5个生物素,标记时,生物素与抗体的比率受抗体浓度影响,对于10 mg/ml 的抗体溶液来说,生物素应超过蛋白12倍(摩尔数),对于2 mg/ml 的抗体溶液应超过20倍,生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物。

1. 抗体/蛋白的前处理:

1.1 选择适当截留的超滤柱中加入400μl 标记反应溶液(0.1M PBS pH 7.2),加入1mg抗体,混匀。

1.2 4℃,6,000rpm,离心2min,弃滤液;于超滤柱中再加入200μl 标记反应溶液,混匀。4℃,6,000rpm,离心2min,

1.3 重复步骤1.2 6~7次。

1.4 混匀超滤柱中的残留的液体,室温静置1min;将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中,4℃,6,000rpm,2min,收集液体。

1.5 取50μl PBS于超滤柱中混匀,静置1min。倒置超滤柱,4℃,6,000rpm,2min,收集液体。

1.6 步骤1.4 与步骤1.5 的收集的滤液合并,用标记反应溶液调节抗体浓度到2mg/ml,4℃放置备用。

2. 生物素的标记:

2.1 将生物素溶解在合适的溶剂中(请参照所选购生物素的说明书,不同的生物素其溶剂不同),浓度为20mg/ml,按照生物素与抗体分子摩尔比1:20的比例加入抗体溶液,室温反应1h。

2.2 葡聚糖凝胶分离纯化/透析袋或者超滤管去除游离生物素及其他试剂。

2.3 将抗体保存于合适的抗体保存液。

 进行抗体标记的时候,需要对抗体性质、交联剂和标记物的性质非常了解,否则很难标记出高品质的抗体;标记量低,导致信号值低;标记量太高,不但容易造成背景,并且还容易由于标记物的聚集造成信号拮抗,反而降低或者淬灭信号值。标记物的种类繁多,不同类型的标记物其性质完全不一样,标记物很难选择和把握,建议初学者使用专业化的试剂盒进行标记,或者直接委托专业化公司标记。福因德生物提供以下抗体标记相关产品,同时可以提供抗体/蛋白标记服务。

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