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细胞线粒体分离试剂盒使用说明

 

细胞线粒体分离试剂盒(Cell Mitochondria Isolation Kit)是用于快速分离培养细胞线粒体的试剂盒。本试剂盒在分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白,可用于研究细胞色素c等线粒体蛋白向胞浆的释放。使用本试剂盒分离获得的线粒体纯度较高,并且绝大部分分离获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜,并具有线粒体的生理功能。因此本试剂盒分离得到的线粒体可以用于线粒体的生理功能等方面的研究。例如可以使用福因德的线粒体膜电位检测试剂盒测定分离得到的线粒体的膜电位。

本试剂盒分离得到的线粒体也可以被试剂盒中的线粒体裂解液或其它适当裂解液裂解后用于SDS-PAGE、Western、双向电泳等蛋白分析。

本试剂盒提供了线粒体制备过程中匀浆程度的重要判断指标,即台盼蓝染色,使分离得到的线粒体的质量更加有保证。台盼蓝染色液为选用试剂,在实验条件成熟后可以不必使用。

本试剂盒提供了蛋白酶抑制剂PMSF,使匀浆时蛋白酶的活性被适当抑制,这样在获得线粒体的同时还可以获得有时有用的去除了大量线粒体的蛋白,在进行蛋白或酶活分析时可以作为对照。

细胞线粒体分离试剂盒使用步骤及方法

1、准备溶液:室温融解试剂盒中的各种溶液,溶解后立即置于冰上并混匀。*次使用时,把1.5ml  PMSF(溶剂)加入到PMSF(晶体)中,溶解并混匀,即得到1.5ml 100mM PMSF。配制好的100mM PMSF溶 液-20℃保存。如果最终目的是制备线粒体蛋白样品,根据样品数量,取适量线粒体分离试剂备用, 在线粒体分离试剂加入到细胞样品中前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。取适量线粒体 裂解液备用,在线粒体裂解液加入到线粒体样品中前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。

2、收集细胞:

 对于贴壁细胞:用PBS洗一遍,用胰酶细胞消化液消化细胞,离心收集细胞。胰酶细胞消化液可以向福因德订购。

  对于悬浮细胞:直接离心收集细胞。

3、洗涤细胞:用冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀,取少量细胞计数,剩余细胞600g,4℃离心5分钟。弃上清。

4、预处理:加入1-2.5ml线粒体分离试剂或临用前添加了PMSF的线粒体分离试剂至2000-5000万细胞中,轻轻悬浮细胞,冰浴放置10-15分钟。

5、匀浆:把细胞悬液转移到一适当大小的玻璃匀浆器中,匀浆10-30下左右。

6、匀浆效果的鉴定:不同细胞不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同,需自行优化。通常可以在匀浆10 次后取约2微升细胞匀浆,加入30-50微升台盼蓝染色液,混匀后显微镜下观察台盼蓝染色阳性(蓝色)细胞的比例。如果阳性细胞比例不足50%,增加5次匀浆。随后再同前取样进行台盼蓝染色鉴定。 当阳性比例超过50%时即可停止匀浆进入下一步。请勿过度匀浆,过度匀浆会导致线粒体的机械损 伤。同时记录对于该细胞的匀浆次数,通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。

7、把细胞匀浆在600g,4℃离心10分钟。

 注:如需获得纯度更高的线粒体,可以将此步骤的离心速度改为1000g,其它离心条件不变;获得 更高纯度线粒体的缺点是相同数量细胞的线粒体抽提得率会下降。

8、小心把上清转移到另一离心管中,在11,000g,4℃离心10分钟。

注:如需获得纯度更高的线粒体,可以将此步骤的离心速度改为3500g,其它离心条件不变;获得 更高纯度线粒体的缺点是相同数量细胞的线粒体抽提得率会下降。

9、小心去除上清。沉淀即为分离得到的细胞线粒体。

注:如果希望获得去除线粒体的细胞浆蛋白,在本步骤需收集上清,并且在收集上清时注意勿触及沉淀。随后把收集的上清12000g,4℃离心10分钟。取上清即为去除线粒体的细胞浆蛋白。

10、线粒体的使用:

1)如果用于完整线粒体的功能或酶活性研究,初始2000-5000万细胞分离得到的线粒体样品中可以加入150-200微升线粒体储存液,重悬线粒体。

2)如果用于线粒体的蛋白分析,初始2000-5000万细胞分离得到的线粒体样品中可以加入150-200微升临用前添加了PMSF的线粒体裂解液裂解线粒体。裂解后的线粒体可以用于PAGE、Western、IP以及线粒体中的一些酶活性的测定等。裂解后的蛋白样品可以使用BCA法测定蛋白浓度。BCA蛋白浓度测定试剂盒(WBR0201/WBR0202)可以福因德购买。

3)如果用于双向电泳,请使用适当的用于双向电泳的裂解液处理线粒体。

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